四、RNA验证CircRNA     和过表达策略相反，我们可以采用RNA干扰技术验证CircRNA。对于内含子环化产生的ciRNA，可以根据内含子序列设计相应的siRNA进行干扰，对于外显子环化产生的CircRNA，可以根据backsplice junction位点处序列信息设计siRNA，最后通过divergent primers鉴定CircRNA敲除倍数。验证策略：可以同时设计三种siRNA，一种是和CircRNA backsplice junction位点靶标结合的siRNA，可以特异性干扰CircRNA的表达；一种是和linear RNA靶标结合的siRNA，可以特异性干扰linear RNA的表达；还有一种是和CircRNA、linear RNA共有的外显子序列结合的siRNA，可以同时干扰CircRNA和linear RNA的表达。

五、荧光原位杂交定位CircRNA     位于细胞核中的ciRNAs主要调控亲本基因的表达，而位于细胞质中的CircRNA主要发挥竞争性内源RNA（ceRNAs）的作用，一般采用荧光原位杂交技术（FISH）对CircRNA进行定位，以便于后续功能的进一步研究，设计的杂交探针需要跨越backsplice junction位点。

六、荧光素酶报告基因检测CircRNA   报告基因表达系统是将报告基因的编码序列与目的基因相结合，将结合基因进行表达，通过检测报告基因的表达产物来测定目的基因的表达量。荧光素酶报告基因系统是以荧光素为底物通过荧光测定仪检测生物荧光进而检测荧光素酶的活性，荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。

七、CircRNA翻译功能验证     CircRNA包含核糖体进入位点，可以翻译表达有效蛋白是最近研究的热点，circRNA翻译功能的验证可以通过NGS和生物信息学方法（翻译组学）对ORF进行预测；外源性功能验证可以通过人工合成小circRNA或者是荧光报告基因对circRNA进行验证；内源性功能验证可以通过Minigene表达载体、蔗糖密度梯度实验、质谱鉴定等方法对circRNA进行验证。其中Minigene表达载体包含circRNA的表达框：外显子侧翼的反向互补序列以及促使环化剪切的介导序列。          Minigene表达载体转染到细胞中可以主动成环，因此是内源性的circRNA的模拟物，转染后可以通过定量PCR检测转染效率，divergent primers鉴定CircRNA表达量。

八、研载生物案例欣赏